مشخصات پژوهش

عنوان	تولید پروتئین ضد دیابتی اکسندین-4 در کاهو و بررسی اثرات ضد دیابتی آن
نوع پژوهش	طرح پژوهشی خاتمه یافته
کلیدواژه‌ها	آگروباکتریوم تومفاشینس، بیان موقت ژن، CTB-EX4، ، اکسندین-4، انتقال ژن، ناقلpBI121 بیان دائم، راه‌انداز MLL،
چکیده	شیوع بیماری دیابت نوع 2، به‌طور قابل توجهی در سراسر جهان رو به افزایش است. پپتید شبه گلوکاگون (GLP-1)، یک هورمون اینکرتینی است که ترشح انسولین را در مسیروابسته به گلوکز، افزایش می دهد. GLP-1 نیمه عمر کوتاهی دارد و در معرض تجزیه سریع آنزیمی قرار می‌گیرد و توسط آنزیم دی پپتیدیل پپتیداز IV به فرم غیر فعال بیولوژیکی خود در میآید. اکسنتاید، یک اکسندین-4 مصنوعی است که آنالوگ GLP-1 می‌باشد و دارای نیمه عمر طولانی‌تر با اثرات انسولین درمانی قوی‌تری است، اما نیاز به نگهداری در دمای پایین و تزریق زیر جلدی روزانه دارد. در این مطالعه، اکسندین-4 جدا‌سازی شده از بزاق مارمولک، که آگونیست GLP-1 می‌باشد، به‌عنوان یک پروتئین متصل شده به زیر‌واحد B سم وبا، به‌طور موقت در گیاه تنباکو بیان شد. ابتدا توالی ژن اکسندین-4 متصل به زیر‌واحد B سم وبا طراحی شد و جایگاههای برش آنزیمی Bam HI وSacI به‌ترتیب در ابتدا زیر‌واحد B سم وبا و در انتهای توالی ژن اکسندین-4 قرار داده شد و سپس سنتز گردید. ژن اکسندین-4 متصل به زیر‌واحد B سم وبا همسانه‌سازی شده در داخل ناقل کلونینگPUC57 ، به باکتری اشرشیاکلی منتقل گردید. سپس پلاسمید pUC57-CTB-EX4 استخراج شده از باکتری اشرشیاکلی، با استفاده از آنزیم‌های محدودکننده Bam HI وSacI برش داده شد و در ناقل دوتایی بیانی pBI121 همسانه‌سازی گردید و از طریق آگرواینفیلتراسیون به برگ گیاه تنباکو انتقال یافت. رونویسی وتولید پروتئین ژن اکسندین-4 متصل به زیر‌واحد B سم وبا، به‌روش RT-PCR و الایزا تاییدشد. سپس ناقلpBI121 دارای قطعه CTB-EX4 توسطAgrobacterium tumefaciens به هسته گیاه کاهو منتقل شد و از میان ریزنمونه‎‌های تلقیح شده 25/20% انتقال ژن با موفقیت صورت گرفت و پس از تایید در آزمون PCR، بذرهای تراریخت نسل اول تهیه گردید. آنالیزهای مولکولی بر روی نسل دوم (T1) گیاهان کاهوی تراریخت حاوی سازه‌ی CTB-EX4 انجام گرفت. با استفاده از RT-PCR و Real time PCR بیان نیمه کمی و کمی مورد بررسی قرار گرفت. همچنین با استفاده از آنتی‌بادی‌های اختصاصی و آزمون‌های ELISA و Western Blot بیان پروتئین بررسی شد. در نهایت تعداد نسخه های انتقال یافته به گیاهان T1 با استفاده از دستگاه Real time PCR با استفاده از روش مطلق و منحنی استاندارد و همچنین روش نسبی، نسبت به ژن کنترل داخلی Actin مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاکی از تراریختگی 60% لاین‌های نسل دوم (T1) و بیان ژن CTB-EX4 در سطح mRNA و پروتئین بود و تفاوت آنان در سطح بیان مشاهده شد. سپس به منظور بیان اختصاصی راه انداز MLL مربوط به بیان اختصاصی در بافت ریشه ذخیره ایی چغندر قند جایگزین راه-انداز CaMV35S در سازه pBI121 حاوی ژن اکسندین-4 متصل به زیر واحد CTB سم وبا شد. از هر دو سازه pBI121-Mll-CTB:Ex4 و pBI121-CaMV35S-CTB:Ex4 برای تراریخت کردن ریزنمونه های برگ هویج با استفاده از باکتری Agrobacterium tumefaciens استفاده شد. ریز نمونه های تراریخت شده در محیط کشت MS درون شیشه به گیاه کامل باززایی شدند سپس به محیط گلدان انتقال یافتند. نتایج بررسی بیان با روش های RT-PCR و ELISA حاکی از بیان ژن CTB-Ex4 در بافت ریشه هویج تحت تنظیم راه انداز MLL بود در حالیکه هیچ بیانی در بافت برگ مشاهده نشد. همچنین نتایج نشان داد که ژن CTB-Ex4 تحت تنظیم راه انداز CaMV35S در هر دو بافت ریشه و برگ بیان شد اما بیان آن در ریشه نسبت به بیان تحت تنظیم راه انداز MLL کمتر بود. نتایج بدست آمده حاکی از توانایی راه‌انداز MLL برای بیان اختصاصی ژن CTB-Ex4 در ریشه گیاه هویج بود. بعلاوه تولید و بیان ژن نوترکیب اکسندین-4 (EX4) متصل به زیر واحد B سم وبا (CTB) در ریشه‌های مویین کاهو (Lactuca sativa L.) به وسیله‌ی تراریختی آگروباکتریوم رایزوژنز سویه‌های ATCC 15834 و 1724 با سازه‌های استخراجی حاصل از کلون های نوترکیب باکتریE.coli سویه ی TOP10 انجام شد. استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن rolB و آغازگرهای اختصاصی ژن CTB-EX4، ریشه مویین بودن و نیز تراریختی نمونه‌ها را تایید نمود. پس از جداسازی نمونه‌های تراریخت از غیر تراریخت، از آن‌ها استخراج RNA صورت گرفت درج و بیان ژن نوترکیب CTB-EX4 در ژنوم ریشه‌های مویین تراریخت شده به واسطه‌ی سویه‌هایA. rhizogenes امکان پذیر بوده و سویه‌ی ATCC 15834 از عملکرد و بازدهی بیشتری در تراریختی برخوردار است.
پژوهشگران	بهمن بهرام نژاد (مجری اول)، شبنم کوکه ای (همکار)، محمد ناجی (همکار)