|
عنوان
|
طراحی و بررسی کارایی کیت االیزا مبتنی بر آنتی بادی تولید شده علیه پروتئین پوششی ویروس ساقه شیاری سیب در Escherichia coli
|
|
نوع پژوهش
|
مقاله چاپ‌شده در مجلات علمی
|
|
کلیدواژه‌ها
|
آنتی بادی، بیان ژن، کاپیلوویروس، وسترن بالت، ویروس ساقه شیاری سیب
|
|
چکیده
|
تولید آنتی بادی و کاربرد آن در آزمون های متنوع و طراحی بیوسنسورها یکی از راهبردهای مهم در تشخیص ویروس های گیاهی است. ویروس ساقه شیاری سیب یکی از ویروس های مهم درختان دانه دار و سیب می باشد. هدف از این تحقیق، بیان ژن پروتئین پو ششی این ویروس در E. coli و تولید آنتی بادی علیه پروتئین بیان شده و ارزیابی آن در آزمون های تشخیصی است.در واکنش زنجیرهای پلیمراز، قطعه ای به طول 714 جفت باز مربوط به ژن کامل پروتئین پوششی ASGV تکثیر و در پلاسمید pTG19 همسانه سازی شد. سپس، قطعه مورد نظر با آنزیم های برشی BamHI و EcoRI خارج و در حامل بیانی pET28a همسانه سازی شد و سازه مورد نظر به منظور بیان ژن هدف، به باکتری E. coli سویه BL21 (DE3) منتقل شد. بهینه سازی بیان در غلظت یک میلی مولار IPTG و زمان های سه، چهار، شش و 16 ساعت پس از القا صورت گرفت و تایید بیان پس از الکتروفورز عمودی و آزمون و سترن بلات انجام شد. پروتئین بیان شده تخلیص و به عنوان آنتی ژن به خرگوش تزریق شد. پس از ایمن سازی سرم، ایمنوگلوبولین ها از سرم خون تخلیص و بخشی از آنها برای تولید کانجوگیت استفاده شدند. در نهایت، کارایی آنها در آزمون های سرولوژیکی ارزیابی شد. نتایج تعیین توالی یابی نشان داد قطعات تکثیر یافته در پی سی آر مربوط به ژن پروتئین پوششی ویروس ساقه شیاری سیب است. نتایج پی سی آر کلونی و هضم آنزیمی تایید کننده ساخت سازه pET28-ASGV-CP بود. تعیین توالی سازه ساخته شده در دو جهت حاکی از قرار گرفتن ژن پروتئین پوششی در قاب صحیح درون پلاسمید بیان و فقدان جهش نوکلئوتیدی بود. پس از بهینه سازی، بیان و استخراج پروتئین پوششی، نوار پروتئینی با اندازه تقریبی 27 کیلودالتون چهار ساعت بعد از القاء در الکتروفورز عمودی و وسترن بالت تایید شد. در الایزی مستقیم، غیر مستقیم و آزمون دیبا، نتایج نشان داد غلظت حدود 1:1000 آنتی بادی تخلیص شده در غلظت مناسب آنتی ژن توانایی واکنش مناسب با آنتی ژن را دارد. آنتی بادی تولید شده و کانژوگه شده در رقت مناسب در تناسب با غلظت آنتی ژن توانایی اختصاصیت و کارایی لازم برای ردیابی و شناسایی ویروس ساقه شیاری سیب را بخوبی دارد. یکی از کاربردهای این آنتی بادی در طراحی انواع کیت های تشخیصی سرولوژیکی مانند الایزا است.
|
|
پژوهشگران
|
امید عینی (نفر چهارم)، محمد حاجی زاده (نفر سوم)، داود کولیوند (نفر دوم)، مهسا محمدلو (نفر اول)
|