مشخصات پژوهش

عنوان	کلونینگ و تخلیص پروتئین S100A9 از نوتروفیلهای پلاسمای انسان و تولید این پروتئین بصورت نوترکیب
نوع پژوهش	پایان نامه
کلیدواژه‌ها	پروتئینS100A9 ، کلون کردن، بیان، تخلیص پروتئین
چکیده	پروتئینهای S100 گروهی از پروتئینهای سیتوپلاسمی چند ژنی می باشند که به یون کلسیم متصل می شوند. این پروتئینها جز‍‍و پروتئینهای اسیدی کوچک (12-10 کیلو دالتونی) هستند که منحصرا در مهره داران یافت می شوند. بیش از 40 سال پیش نخستین اعضای خانواده پروتئینی کشف و از مغز گاو تخلیص شد. علت نامگذاری این پروتئین به S100 حلالیت 100% آنها در سولفات آمونیوم می باشد. اغلب ژنهای S100 در یک مجموعهژنی در ناحیه ای واقع در قطعه 21 بازوی بلند کروموزوم شماره یک(1q21) انسان فرار دارند. این ناحیه مسئول بسیاری از ناهنجاریهای کروموزومی محسوب می شود. یکی از پروتئینهای خانواده S100 ، پروتئین S100A9 است که یک پروتئین متصل شونده به یون کلسیم و دارای 113 اسید امینه با وزن مولکولی 13 کیلو دالتون می باشد. این پروتئن از فاگوسیتهای فعال شده ازاد می شود و بطور مستقیم سلولهای اندوتلیال و فاگوسیتهای تک هسته ای و لنفوسیتها را از طریق برهمکنش با گیرنده RAGE و TLR-4 فعال می کند. پروتئین S100A9 از جمله واسطه های مولکولی مهم در بسیاری از بیماریها از جمله آرتریت التهابی، تصلب شرایین و عفونتهای میکروبی می باشد.S100A8 و S100A9 چون دارای نقش دوگانه ای در خارج و داخل سلول هستتند فعالیت خود را به شکل هترودیمر S100A9/A8 انجام می دهند. هترودیمر S100A9/A8 دارای عملکردهای ایمونولوژیکی متفاوتی است از جمله: در فعالیتهای وابسته به کلسیم در طی التهاب نقش مهمی دارد. این نقش شامل فعالسازی Mac-1 و اینتگرین beta2 می باشد که در اتصال نوتروفیل به سلولهای پوششی شرکت می نماید. در این تحقیق، بعد از طراحی پرایمر برای ژن S100A9، واکنش PCR برای تکثیر این ژن انجام گرفت. بعد از آن محصول PCR در ناقل بیانی +pET-28a کلون شد. ناقل نوترکیب به باکتری EcoliBL21DE3 انتقال یافته و توسط IPTG القا شد.بیان پروتئین مورد نظر در سویه باکتری EcoliBL21DE3 مورد ارزیابی قرار گرفت و به وسیله ایمونوبلاتینگ تایید شد. فرایند بیان با تغییر سه پارامتر اصلی( زمان- دما- غلظت IPTG) بهینه شد. بهینه سازی نشان داد که میزان بالایی از پروتئین نوترکیب S100A9 بر روی ژل مشاهده می شود. بهترین شرایط بیان در دمای 37 درجه سانتیگراد، مدت زمان 12 ساعت بعد از غلظت 5Mm از IPTG ایجاد می شود. در نهایت پروتئین نوترکیب S100A9 به وسیله ستون نیکل تخلیص شد.
پژوهشگران	مهدی کمالی (استاد مشاور)، حسین علی مهرانی (استاد مشاور)، مصطفی قانعی (استاد راهنما)، جلال رستم زاده (استاد راهنما)، فریبا خلیلی (دانشجو)