یاور وفائی

سابقه و هدف: آنغوزه تلخ Ferula pseudalliacea گیاهی از خانواده چتریان، چند ساله و مونوکارپیک می باشد. رویشگاه این گیاه آسیای مرکزی تا نوار شمالی اروپا می باشد. ترکیبات اصلی تشکیل دهنده متابولیت های ثانویه این جنس شامل کومارین ها، سزکوئی ترپن کومارین ها و دی سزکوئی ترپن کومارین ها می باشد. با توجه به ترکیبات موجود در این گیاه از گذشته های دور توسط مردم بومی در طب سنتی به صورت گسترده استفاده شده است. مسیر اصلی بیوسنتز ترکیبات موثر این گیاه مسیر فنیل پروپانوئید است. یکی از آنزیم های اصلی و کلیدی این مسیر سینامات- 4- هیدروکسی لیاز است. هیچ اطلاعات ژنومی از ژن های این گیاه دارویی با ارزش وجود ندارد و به عنوان اولین گزارش ، ژن C4H از این گیاه همسانه و توالی یابی شد و میزان بیان آن در ریشه، ساقه، برگ، گل آذین و بذر نارس مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روش ها: قسمت های مختلف گیاه Ferula pseudalliacea در اوایل خردادماه از جنوب شرقی روستای گزنه در 20 کیلومتری سنندج جمع‎ آوری گردید. استخراج RNA از بافت های مختلف گیاه Ferula pseudalliacea با روش لیتیم کلرید انجام گرفت. جهت سنتز cDNA ، از کیت سنتز cDNA شرکت یکتا تجهیز در حجم 20 میکرولیتر استفاده شد. محصول پی سی آر با استفاده از آغازگر طراحی شده از نواحی حفاظت شده ژن C4H، درون ناقل pTG19 همسانه شد. نمونه های پلاسمید نوترکیب بعد از تایید مولکولی ، جهت تعیین توالی به شرکت آپلاید بیوسیستم ارسال شد. جهت ارزیابی میزان بیان ژن C4H از دو روش واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی و روش نیمه کمی استفاده شد. دندروگرام داده های به دست آمده از توالی یابی هر ژن، با استفاده از نرم افزار مگا با روش آماری اتصال همسایگی با میزان بوت سترپ برای توالی پروتئینی رسم شد. یافته ها: توالی های به دست آمده از کلون های ژن C4H در پایگاه داده ان سی بی آی با استفاده از BlastX همردیف شد و با توجه به نتیجه بلاست، توالی های دو ژن ذکر شده تایید گردید. این ژن با ژن های C4H سایر گیاهان هم خانواده خود در یک گروه قرار گرفت. این ژن بالاترین تشابه را در هر دو سطح توالی نوکلئوتیدی و پروتئین با ژن C4H هویج نشان داد که با هم در یک زیر گروه قرار گرفتند. ژن C4H دارای 7 موتیف بوده که موتیف حفظ شده سیتوکروم سیستئین P450 با توالی FGVGRRSCPG در خانواده سیتوکروم P450 جز آنها می باشد. بررسی بیان ژن با واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی بالاترین سطح رونویسی را در گل آذین و کمترین میزان بیان را در برگ نشان داد. نتیجه گیری: C4H به عنوان دومین ژن کلیدی مسیر فنیل پروپانوئید نقش انکارناپذیر در تولید ترکیبات فنلی در بافت های ویژه همانند گل آذین که بیشترین میزان بیان را نشان داد، دارد. سایر پژوهش های انجام شده درگیاهان مختلف در زمینه بیان ژن C4H نشان از اختصاصی عمل کردن در تولید ترکیب های خاص، در بافت خاصی بوده است. با توجه به اینکه ترکیبات فنلی دامنه وسیعی از متابولیت‎های ثانویه را به صورت مواد فرار (اسانس) و عصاره شامل می شود برای پی بردن به نقش دقیق آنزیم C4H در اندام های مختلف نیاز به تحقیق بیشتر می باشد. با توجه به نقش انکارناپذیر ژن C4H در بیوسنتز بسیار از ترکیبات با ارزش دارویی، از توالی شناسایی شده می توان در تولید ترکیبات نوترکیب در سایر گونه های گیاهی که پیش ماده های مورد نظر را دارند، استفاده نمود.