قدرت تفکیک یک میکروسکوپ به عنوان کمترین فاصله بین دو نقطه روی نمونه که می توانند از هم، تفکیک شوند، تعریف می شود. قدرت تفکیک میکروسکوپ نوری در دو بعد به وسیله ی معیار رایلی محدود می باشد. کاملاً واضح است که معیار رایلی آمار گسیل فوتون داده های به دست آمده را نادیده می-گیرد. اخیراً رام و همکارانش از یک چهارچوب تصادفی برای تعیین قدرت تفکیک استفاده کرده اند که محدودیت های معیار رایلی را ندارد. آنها نشان دادند که قدرت تفکیک میکروسکوپ نوری معمولی محدود نمی باشد بلکه، تحت تأثیر شمار فوتون های آشکار شده، پیکسل بندی آشکارساز، بزرگنمایی سیستم نوری، نویزهای قابل خواندن آشکارساز، فوتون های پراکنده و چرخش دو ذره قرار می گیرد. میکروسکوپ فلورسنسی بازتابش داخلی کلی یک سیستم تصویربرداری میدان گسترده است که برای تصویربرداری از غشاء سلول و حوادث سلولی در مرز شیشه و مایع به کار می رود. در این میکروسکوپ میدان میرای پرتو بازتابش داخلی کلی به عنوان منبع نور برای تحریک فلورفورهای نزدیک به محیط و فاصله ی حدود صد نانومتر از پوشش شیشه ای به کار می رود.چون میدان میرا به عنوان منبع روشنایی استفاده می شود، قدرت تفکیک محوری این میکروسکوپ خیلی کوچکتر از قدرت تفکیک میکروسکوپ های نوری معمولی است. از آنجایی که قدرت تفکیک برای این میکروسکوپ تا به حال نه به صورت تجربی و نه به صورت تئوری تعیین نشده است، ما در این تحقیق قدرت تفکیک را برای این میکروسکوپ و میکروسکوپ نوری معمولی به روش رام در یک چهارچوب تصادفی بررسی کردیم. دو ذره را در یک میدان میرای پرتو بازتابش داخلی کلی در نظر گرفتیم. با استفاده از ماتریس فیشر مقدار خطا را در تعیین فاصله ی دو ذره به دست آوردیم. برای میکروسکوپ TIRF مقدار خطا کمتر از میکروسکوپ نوری معمولی است. همچنین فهمیدیم که پارامترهای آزمایشگاهی نظیر: اندازه و تعداد پیکسل های آشکارساز، نویزهای آشکارشده، بزرگنمایی سیستم نوری و چرخش دو ذره می تواند روی خطای تعیین فاصله ی دو ذره تأثیر گذار باشند.
