یاور وفائی

تا سال 2009 حدود 3/33 میلیون نفر آلوده به ویروس HIV بوده اند. ایدز با روش های کنونی قابل درمان نیست اما پروتیین گریفیتسین GRFT توانایی غیرفعال کردن HIV و جلوگیری از انتقال سلول به سلول HIV را دارد. هدف رساله حاضر بیان این پروتیین ضد ویروس در ژنوم هسته ای کاهو و تنباکو به عنوان میزبان های گیاهی و نیز بیان در باکتری E .coli به عنوان یک سیستم پروکاریوتی جهت استفاده به صورت استاندارد در آزمون الیزا و نیز تهیه آنتی بادی می باشد. از طرف دیگر برای بهینه سازی انتقال ژن به ژنوم پلاستیدی کاهو و تنباکو سیستم همسانه سازی Golden braid برای ساخت سازه های تراریزش کلروپلاستی مورد استفاده قرار گرفت. به این منظور ابتدا سازه ژنی GRpET28 حاوی ژن GRFT به باکتری بیانی سویه BL21 منتقل شد و با القای بیان توسط IPTG، پروتئین به دو صورت دناتوره و غیردناتوره بیان شد. برای انتقال ژن GRFT به ژنوم هسته ای کاهو و تنباکو نیز، ابتدا توالی ژن بر اساس ترجیح کدونی گیاه کاهو بهینه سازی شد، سپس دو سازه ژنی pBIgR-KD و pBIgR-ZR ساخته شدند که ژن GRFT به ترتیب تحت کنترل پپتید راهنمای KDEL و بخش انتهای N پپیتد راهنمای Zera قرار گرفت. برای ساخت ناقل های تراریزش کلروپلاست کاهو و تنباکو راه انداز های Prrn، PpsbA، خاتمه دهنده های TpsbA و Trp16 و نواحی الحاقی rbcL و accD از هر دو گیاه کاهو و تنباکو تکثیر و همسانه شد و پس از ساخت واحدهای بیانی برای ژن GRFT و ژن aadA در نهایت دو ناقل PGCL2 و PGCN1 به ترتیب برای تراریزش کاهو و تنباکو ساخته شد و ریزنمونه های کوتیلدون کاهو و برگ تنباکو به وسیله ذرات طلای پوشش دار شده با ناقل های ساخته شده بمباران شدند و بروی محیط کشت انتخابی حاوی اسپکتینومایسین کشت شدند. برای به دست آوردن گیاهان تراریخت هسته ای، لپه های 5 روزه کاهو رقم TN 96-39 و قطعات برگی تنباکو رقم سامسون با آگروباکتریوم سویه LBA4404 حاوی سازه های مورد نظر تلقیح شد. شاخساره های تشکیل شده بروی محیط MS حاوی کانامایسین به محیط القای ریشه (½ MS بدون هورمون) منتقل شدند. بررسی شاخساره های تراریخت مقاوم به کانامایسین با PCR و سادرن بلات الحاق موفق دو تا سه نسخه از ژن GRFT را در لاین های کاهو و تنباکوی مورد بررسی نشان داد. بررسی بیان گریفیتسین در سطح رونوشت با RT-PCR و Real Time PCR نشان از قابلیت متفاوت لاین های تراریخته د