در این پژوهش اثر مصرف طولانی مدت داروی متوتروکسات، که هم برای درمان سرطان و هم برای بیماری‌های خودایمنی استفاده می‌شود، بر ساختار و فعالیت آنزیم پپسین تحت عنوان یکی از مهمترین آنزیم‌های معده با روش‌های تجربی، محاسباتی و نرم افزاری مورد مطالعه قرار گرفت. مطابق با نتایج به‌دست‌آمده از ازمایشات طیف سنجی مرئی-فرابنفش و فلورسانس مشخص شد که دارو می‌تواند با آنزیم پیوند برقرار کند و شدت فلورسانس آنزیم پپسین از طریق مکانیسم خاموش کردن ترکیبی استاتیک-دینامیک خاموش شد. همین‌طور تجزیه و تحلیل پارامترهای ترمودینامیکی اتصال دارو به آنزیم نشان داد که نیروهای اصلی در تشکیل کمپلکس، پیوندهای هیدروژنی و یونی است. در آزمایشات مراحل بعدی که اثرات دارو بر فعالیت آنزیم مورد بررسی قرار گرفت و نتایج به‌دست‌آمده نشان داد که در حضور دارو، فعالیت آنزیمی پپسین مهار شد و پارامترها نشان داد که مهار آنزیم از نوع نارقابتی است. در مطالعات مربوط به FTIR مشخص شد که اتصال دارو به آنزیم تغییرات قابل توجهی در ساختار آنزیم ایجاد نکرده و احتمالاً گروه‌های آمینی در متوتروکسات درگیر پیوند با آنزیم هستند. همچنین دناتوراسیون حرارتی آنزیم پپسین در حضور دارو نشان داد که دارو انرژی فعال‌سازی دناتوراسیون حرارتی آنزیم پپسین را افزایش داده و به عبارتی دارو باعث افزایش پایداری حرارتی آنزیم پپسین شد. در آخر با انجام فرایندهای داکینگ مولکولی، انرژی اتصال میان لیگاند و پروتئین و آمینواسیدهای درگیر در این اتصال مشخص شد .
