محمد حاجی زاده

یکی از ویروس های مهم آلوده کننده درختان میوه ویروس لکه برگی کلروتیک سیب (Apple chlorotic leaf spot virus) است و تهیه آنتی بادی و طراحی کیت الایزا و بیوسنسورها یکی از راهبردهای مفید در تشخیص زود هنگام عوامل بیماریزا در نمونه‌های با تعداد زیاد است. در همین راستا، تحقیق حاضر با هدف تولید آنتی بادی چندهمسانه ای نوترکیب و طراحی کیت الایزا جهت ردیابی سریع ویروس لکه برگی کلروتیک سیب با استفاده از بیان در سیستم پروکاریوتی انجام شد. ابتدا سازه-ACLSV-CP pTG19 به باکتری Escherichia coliسویه DH 5α منتقل و پس از تکثیر و استخراج پلاسمید نوترکیب، ژن پروتئین پوششی با استفاده آنزیم های برشی خارج و درون پلاسمید بیان pET 28(a) همسانه سازی گردید. سازه بیان pET 28(a)-ACLSV-CP ساخته شده به منظور بیان پروتئین، به باکتری E. coli سویه BL21 (DE3)منتقل شد. پس از بهینه سازی، بیان و استخراج پروتئین پوششی، نوار پروتئینی با اندازه تقریبی 27 کیلودالتون چهار ساعت بعد از القاء مشاهده شد. سپس، پروتئین بیان شده روش طبیعی با ستونNi-NTA Agarose خالص سازی شد. پروتئین خالص شده به عنوان آنتی ژن به خرگوش ماده نژاد نیوزیلندی طی چهار مرحله تزریق شد. ایمنوگلوبولین ها با استفاده کیت تخلیص IgG مبتنی بر پروتئین A 1 از سرم خون به دست آمده از خرگوش های ایمن شده تخلیص شدند. کارایی ایمنوگلوبولین های خالص شده، نشان داد که کاربرد غلظت 1:1000 آنتی بادی نوترکیب تهیه شده و نشاندار برای ردیابی آنتی ژن های موردنظر مناسب هستند. نتایج آزمون های مختلف نشان داد، آنتی بادی تولید شده جهت ردیابی ویروس لکه برگی کلروتیک سیب دارای اختصاصیت و کارایی مناسب است و از این آنتی بادی ها می توان برای شناسایی این ویروس به منظور غربال درختان و یا نمونه های مشکوک استفاده کرد.