بهمن بهرام نژاد

به دلیل تولید پروتئین‌های نوترکیب با هزینه‌ پایین، تولید انبوه و ایمنی بالا گیاهان به عنوان میزبان‌ها ی مناسبی برای سیستم‌های رایج تولید پروتئین‌های نوترکیب دارویی مطرح می‌باشند. اکسندین-4 (EX-4) یک پروتئین شبیه به پپتید شبه گلوکان (GLP-1) است که در القای ترشح انسولین در بدن نقش دارد. اتصال پپتید EX-4 به زیر واحد B سم وبا (CTB) باعث افزایش کارایی آن از طریق افزایش جذب توسط سیستم گوارشی می شود. ناقلpBI121 دارای قطعه CTB-EX4 توسط آگروباکتریوم تومه‌فاشینس به هسته گیاه کاهو معرفی شد. در این تحقیق نسل دوم (T1) گیاهان کاهوی تراریخت شده با ژن CTB-EX4 با آنالیزهای مولکولی برای تراریختگی و بیان ژن CTB-EX4 در سطح RNA و پروتئین مورد بررسی قرار گرفت. تعداد 24 گیاهان رشد یافته از بذرهای T0 با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن CTB-EX4 و آزمون PCR مورد بررسی قرار گرفتند. از گیاهان تائید شده RNA استخراج شد و بیان ژن CTB-EX4 در سطح RNAبا استفاده از روش های نیمه کمی با PCR و کمی با استفاده از دستگاهPCR Real time و روش2-∆∆Ct مورد بررسی قرار گرفت. بیان ژن CTB-EX4 همچنین در سطح پروتئین با استفاده از آزمون های ELISA و Western blot با استفاده از آنتی بادی اختصاصی CTB-EX4 مورد بررسی قرار گرفت. در نهایت تعداد نسخه های انتقال یافته به گیاهان T1 با استفاده از دستگاه Real time PCR با استفاده از روش مطلق و منحنی استاندارد و همچنین روش نسبی، نسبت به ژن کنترل داخلی Actin مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد ازتعداد 24 عدد بذر T0 کشت شده، 42% به صورت کامل رشد کردند و به بذر نشستند. در 60% از لاین‌های نسل دوم (T1) با استفاده از واکنش PCR، تراریختگی و حضور ژن CTB-EX4 تایید شد. نتایج بررسی بیان با استفاده از RT-PCR، Real time PCR، ELISA و Western Blot حاکی از بیان ژن CTB-EX4 در سطح mRNA و پروتئین بود و تفاوت آنان در سطح بیان مشاهده شد، به طوری که بیشترین مقدار بیان در سطح پروتئین و هم در سطح mRNA در لاین 105 مشاهده شد. نتایج آزمون تعیین تعداد نسخه انتقال یافته حاکی از انتقال بیشترین تعداد نسخه در لاین 101 شامل 7 انتقالی نسخه بود. نتایج حاصل نشان داد که فرآیند انتقال ژن CTB-EX4 موفقیت‌آمیز بود و با در نظر گرفتن فرآیند‌های بعدی از جمله تخلیص و ارزیابی فعالیت بیولوژیکی پروتئین تولید شده، از گیاهان می‌توان به عنوان یک بیوراکتور مناسب جهت تولید پروتئین‌های نوترکیب بهره برد.