بهمن بهرام نژاد

میزان ابتلای افراد به بیماری دیابت نوع 2 (T2DM) هم اکنون در جهان و نیز کشور ایران به گونه ی قابل توجهی در حال افزایش می باشد. طبق آن چه پیش بینی شده، تا سال 2045 میلادی، حداقل تعداد 629 میلیون نفر به این بیماری مبتلا خواهند بود. تا کنون هیچ گونه درمان کاملاً مؤثری که فاقد عوارض جانبی باشد و یا از وقوع بیماری بتواند جلوگیری کند، موجود نیست. در همین زمینه، تحقیقات بسیاری انجام گرفته که از جمله ی آن ها می توان به روش های استفاده از سیستم های بیان گیاهی به منظور تولید داروها و پروتیین های نوترکیب درمانی و امکان مصرف آن ها از راه خوراکی اشاره نمود. استفاده از چنین سیستم تولیدی به دلیل مزایای بسیاری که دارد، قادر است هزینه های تولید و درمان را پایین آورد. بنابراین در این پژوهش، به منظور تولید و بیان ژن نوترکیب اکسندین-4 (EX4) متصل با زیرواحد B سم وبا (CTB) در ریشه های مویین کاهوی (Lactuca sativa L.)، از سویه های A. rhizogenes ATCC 15834 و 1724 استفاده شد. برای این کار، ابتدا استخراج سازه از باکتری E. coli سویه ی TOP10حاوی ناقل بیان دوتایی pBI121-CTB-EX4 انجام گرفت و با روش ذوب و انجماد، انتقال سازه ی استخراج شده به سلول های مستعد تهیه شده از سویه های A. rhizogenes صورت پذیرفت. سپس آگروباکتریوم های تراریخت شده ی حاوی ژن نوترکیب، به روش دیسک برگی با گیاه کاهو تلقیح شدند و ریشه های مویین پس از 10 روز از محل های زخمی ریزنمونه های کاهو، ظاهر گردید. از ریشه های مویین حاصل، استخراج DNA و RNA صورت گرفت تا در سطوح مختلف مولکولی نیز ادغام ژن نوترکیب در ژنوم ریشه ها و بیان ژن تأیید گردد. آنالیز نمونه های نوترکیب و شاهد از طریق آزمون های PCR و PCR نیمه کمی (RT-PCR)، با استفاده از آغازگرهای اختصاصی طراحی شده برای ژن های rolB، CTB-EX4 و Actin انجام شد و باندهای مورد انتظار در نمونه های تراریخت، مشاهده گردید. در هر مرحله نمونه های تراریخت از سایر نمونه های غیرتراریخت جدا شدند تا در مراحل بعدی از آن ها استفاده شود. در روش RT-PCR، پس از سنتز cDNA از RNAهای استخراجی، میزان بیان ژن CTB-EX4 در نمونه ها بر اساس ژن مرجع Actin با استفاده از نرم افزار GelQuantNET اندازه گیری و مقایسه شد. نتایج نشان داد بیان ژن نوترکیب CTB-EX4 در ریشه های مویین تراریخت با موفقیت صورت گرفته و در مقایسه میانگین بیان نسبی ژن CTB-EX4 پس از آنالیز داده ها با نرم افزار SAS 9.3، عملکرد سویه ی ATCC 15834 نسبت به سویه ی 1724 بالاتر ارزیابی شد.