اسعد معروفی

بیماری‌های قلبی و عروقی یکی از دلایل شایع‌ مرگ‌ و‌ میر در جهان هستند. گرفتگی رگ‌ها یکی از مهمترین این بیماری‌ها می‌باشد. از روش‌های مهم جهت درمان این عارضه حذف لخته‌های خونی از سیستم گردش خون است. پروتئین فعال‌کننده پلاسمینوژن بافتی (tPA ) تجزیه لخته های خون را تسهیل می کند. بنابراین در پزشکی نیازی مبرمی به این پروتپین احساس می شود. تولید پروتئین‌ نوترکیب فعال‌کننده پلاسمینوژن بافتی در سیستم‌های بیانی از راهکارهای بسیار با ارزش برای رفع این نیاز است. امروزه استفاده از سیستم‌های گیاهی جهت تولید پروتئین‌های نوترکیب در حال گسترش است. بدین منظور امکان تولید پروتئین نوترکیب tPA در گیاه گوجه فرنگی (رقم کال ‌جی ) با استفاده از انتقال موقت در این تحقیق بررسی شد. ابتدا بهینه‌سازی بیان موقت با استفاده از ژن GFP به روش اگرواینفیلتریشن انجام شد. در این آزمایش تاثیرات سه فاکتور مهم شامل غلظت اگروباکتریوم (4/0، 6/0 و 8/0 OD600)، سه زمان برداشت پس از تلقیح (4، 7 و 10 روز) و دو حالت با حضور ژن سرکوبگر خاموشی P19 و بدون آن، بر بیان موقت ارزیابی شدند. سپس در آزمایش دوم امکان تولید و تخلیص پروتئین نوترکیب فعال‌کننده پلاسمینوژن بافتی با استفاده از بیان موقت انجام شد. ناقلین مورد استفاده در این تحقیق شامل pXK2FS7 ، pCAMBIA1304-rtPA و pCAMBIA1304-P19 بودند. در هر دو آزمایش گیاهان گوجه فرنگی در مرحله رویشی برای اگرواینفیلتریشن انتخاب شدند. بیان ژنها با استفاده از روش Real Time PCR مورد ارزیابی قرار گرفت. تولید پروتئین نوترکیب rtPA با استفاده از آزمون وسترن بلات و الایزا بررسی شد. در نهایت تخلیص پروتئین نوترکیب rtPA با استفاده از روشهای مبتنی بر کروماتوگرافی تمایلی، هیدروفوبین و پلی پپتیدهای شبه الاستین انجام شد. نتایج آزمایش اول نشان داد که غلظت باکتری، تعداد روزهای پس از تلقیح و وجود ژن سرکوبگر ویروسی P19 بر بیان موقت ژن GFP اثرات معنی‌داری دارند. آزمایش اول نشان داد که حضور ژن P19 به عنوان سرکوبگر سیستم خاموشی ژن در مقایسه با عدم حضور آن باعث بیان بیشتر ژن GFP شد. همچنین غلظت OD600 6/0 اگروباکتریوم مناسب‌ترین غلظت باکتری برای اگرواینفیلتریشن بود. و در مدت زمان 7 روز پس از تلقیح بالاترین میزان رونویسی ژن GFP ثبت شد. در آزمایش دوم مشخص شد که فاکتورهای جایگاه برگ، وجود ژن P19 و تعداد روز پس از تلقیح اثرات متفاوتی بر روی میزان بیان ژن rtPA دارند. ضمن اینکه تولید پروتئین نوترکیب rtPA در برگها به روش وسترن بلات تایید شد. نتایج الایزا هم علاوه بر تایید تولید پروتئین نوترکیب نشان داد که جایگاه برگ، وجود ژن P19 و تعداد روز پس از برداشت بر روی میزان تولید پروتئین نوترکیب rtPA اثرات متفاوتی دارند. در نهایت تخلیص پروتئین با استفاده از روش کروماتوگرافی تمایلی به کمک هیستیدین، روش هیدروفوبین و پلی پپتیدهای شبه الاستین با موفقیت انجام شد.