اسعد معروفی

هدف از این تحقیق بهره گیری از گیاه گوجه فرنگی رقم کال جی به عنوان یک گیاه مدل برای انتقال موقت جهت تولید ترکیبات دارویی و صنعتی است. به منظور بررسی انتقال موقت ژن، سه غلظت اگرو باکترویوم در OD600 (4/0، 6/0 و 8/0)، سه زمان پس از تلقیح (4، 7 و 10 روز) و دو حالت با حضور ژن p19 و بدون p19 به عنوان فاکتورهای موثر بر بیان موقت ژن انتخاب شدند. ناقلین مورد استفاده در این تحقیق pXK2FS7 و pCAMBIA1304 به ترتیب حاوی ژن های GFP و P19 بودند. برای انتقال موقت ژن GFP، برگ گیاهچه های 6 برگی با استفاده از روش اگرواینفیلتریشن تلقیح شدند. بدین صورت که غلظت های مختلف از اگروباکتریوم حاوی ناقل pXK2FS7 و ناقل P19 با یکدیگر مخلوط شدند و بیان ژن GFP بررسی گردید. همه برگ های گیاهان گوجه فرنگی در مرحله مناسب رشدی توسط سرنگ انسولین بدون سوزن در سطح زیرین برگ تزریق شدند. به منظور تایید تراریختی و انتقال ژن استخراج RNA، ساخت cDNA و میزان بیان ژن GFP با استفاده از روش Realtime PCR انجام شد و نهایتا مشاهده بیان پروتیین GFP با میکروسکوپ فلوریوسانس صورت گرفت. نتایج نشان داد که غلظت باکتری، تعداد روزهای پس از تلقیح و بیان ژن p19 (پروتیین سرکوب کننده خاموشی ژن) بر بیان ژن GFP اثرات معنی داری دارند. به طوری که حضور ژن p19 به عنوان سرکوبگر سیستم خاموشی ژن در مقایسه با عدم حضور در همه حالات باعث بیان بیشتر ژن GFP گردید. همچنین مشخص شد که رقت OD600 6/0 اگروباکتریوم مناسب ترین غلظت برای اگرواینفیلتریشن GFP است. به علاوه در 7 روز پس از تلقیح، بالاترین میزان رونویسی ژن GFP بدست آمد. بهترین ترکیب به منظور حصول حداکثر میزان رونویسی ژن GFP، حضور ژن p19، غلظت 6/0 OD600 اگروباکتریوم و جمع آوری نمونه های برگی 7روز بعد از تلقیح می باشد. نتایج حاصل از این تحقیق می تواند در مطالعات مقدماتی و یا بهینه سازی تولید پروتیین های نوترکیب در برگ های گوجه فرنگی مورد استفاده قرار گیرد.