راحله شاکری

مقدمه و هدف: کاسپاز-9 نقش اساسی در شروع آپوپتوز دارد و در نتیجه فعالیت آن از طریق مکانیسم‌های تنظیمی مختلف به شدت کنترل می‌شود. کاسپاز-9 به عنوان گیرنده اصلی فسفوریلاسیون تنظیمی توسط پروتئین کینازهای مختلف عمل می کند که در حضور عوامل رشد/بقای خارج سلولی، استرس اسمزی یا در طول میتوز فعال می شوند. آنالیزهای طیف سنجی جرمی گزارش کرده اند که Ser302 و Ser307 در کاسپاز 9 انسانی نسبت به فسفوریلاسیون حساس هستند. مواد و روش‌ها: به منظور افزایش درک در مورد تأثیر فسفوریلاسیون کاسپاز-9 انسانی در Ser302 و Ser307 بر فعالیت آنزیم، سه نوع فسفومیمتیک کاسپاز-9 نوترکیب ساخته شد. دو جهش مختلف در این مطالعه معرفی شدند: یک جهش شامل تغییر باقیمانده Ser302 به آسپارتات، در حالی که جهش دیگر شامل تغییر باقیمانده Ser307 به آسپارتات بود. علاوه بر این، یک نوع سوم ایجاد شد که در آن هر دو باقی مانده Ser302 و Ser307 به آسپارتات جهش یافته بودند. روش QuickChange برای تولید ساختار جهش یافته استفاده شد. بیان آنزیم های جهش یافته کاسپاز-9 در اشریشیاکلی (E. coli) انجام شد و پس از آن با استفاده از کروماتوگرافی میل ترکیبی خالص سازی شد. سوبسترای کروموژنیک Ac-LEHD-pNA برای سنجش آنزیمی کاسپاز-9 استفاده شد. علاوه بر این، مشخصات دمایی فعالیت آنزیم برای هر گونه ارزیابی شد. نتایج: این مطالعه نشان داد که هر دو جهش S302D و S302D/S307D فاقد فعالیت آنزیمی هستند. بررسی مطالعات سینتیکی جهش نقطه‌ای S307D، افزایش 10 برابری ثابت Michaelis (Km) برای سوبسترا و افزایش 4 برابری در حداکثر سرعت واکنش (Vmax) را در مقایسه با نوع وحشی آنزیم نشان می‌دهد. مقدار kcat/km کاسپاز-9 نوع وحشی سه برابر بیشتر از نوع S307D بود. محدوده دمایی که نتایج بهینه را برای نوع وحشی به همراه داشت بین 30 تا 37 درجه سانتی گراد مشاهده شد، در حالی که برای نوع S307D، محدوده دمایی بهینه بین 37 تا 45 درجه سانتی گراد بود. جهش‌های S302D و S302D/S307D فقدان فعالیت آنزیمی را در تمام دماهای مورد بررسی نشان دادند. بحث و نتیجه‌گیری: باقی مانده Ser302 نقش مهمی در فعالیت کاسپاز 9 انسانی در شرایط آزمایشگاهی ایفا می کند. به طور خاص، وارد کردن یک بار منفی در Ser302 منجر به غیرفعال شدن کامل آنزیم می شود. علاوه بر این، کاهش کارایی کاتالیتیکی با القای بار منفی در Ser307 کاسپاز-9 مشاهده شده است.