راحله شاکری

کاسپاز-9 یک آنزیم کلیدی در مسیر داخلی آپوپتوز است که فعالیت آن با سازوکارهای مختلفی مانند فسفریلاسیون تنظیم می شود. گزارش شده است که فسفریلاسیون سرین 310 در کاسپاز-9 موشی مانع پردازش آنزیم می شود. نقش این باقیمانده ی آمینواسیدی در فعالیت آنزیمی کاسپاز-9 انسانی نامشخص است. در این پژوهش اثر ایجاد بار منفی روی سرین 310 در فعالیت آنزیمی کاسپاز-9 انسانی مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به اینکه فسفریلاسیون منجر به ایجاد بار منفی در کاسپاز-9 می شود، کدون سرین 310 در کاسپاز-9 انسانی به کدون آسپارتات با استفاده از روش جهش زایی هدفمند Quick change جهش داده شد. کاسپاز-9 نوترکیب وحشی و جهش یافته در سویه باکتری BL21(DE3) بیان و با استفاده از کروماتوگرافی گرایشی تخلیص شدند. پروفایل دمایی و فعالیت کاسپاز-9 جهش یافته در مقایسه با آنزیم وحشی به کمک سوبسترای کروموژنیک Ac-LEHD-pNA در شرایط in vitro سنجش شد. تجزیه و تحلیل آماری داده ها با آزمون t انجام شد. نتایج نشان داد که پارامترهای سینتیکی کاسپاز-9 جهش یافته ی S310D و آنزیم وحشی مشابه هستند، اما پروفایل دمایی آنها متفاوت است. آنزیم جهش یافته ی S310D در دمای 37 درجه ی سانتی گراد فعالیت بیشتر و در دماهای 4، 15، 45 و 60 درجه ی سانتی گراد فعالیت کمتری در مقایسه با آنزیم وحشی داشت. بنابراین ایجاد بار منفی بر روی سرین 310 در کاسپاز-9 بدون تاثیر بر پارامترهای سینتیکی سبب تغییر در پروفایل دمایی آنزیم می شود.