راحله شاکری

کاسپاز-9 یک عامل کلیدی در مسیر مرگ میتوکندریایی است که فعالیت آن با سازوکارهای مختلفی تنظیم می شود. یکی از این سازوکارهای تنظیمی، فسفریلاسیون است که توسط کینازهای فعال شده در مسیرهای پیام رسانی مختلف در سلول اعمال می شود. فسفریلاسیون کاسپاز-9 بسته به باقیمانده ی آمینواسیدی اثر فعال کنندگی یا مهاری بر فعالیت آنزیم دارد. تحقیقات نشان داده است که باقیمانده ی سرین در موتیف Φ-X-X-S/T (Φ: اسیدآمینه ی آبگریز، X: هر نوع اسیدآمینه، S: سرین و T: ترئونین) مستعد فسفریلاسیون توسط سرین/ترئونین کینازها است. با توجه به قرارگیری سرین 334 در توالی آمینواسیدی کاسپاز-9 در چنین موتیفی، به نظر می رسد این ریشه هم مستعد فسفریلاسیون باشد. با توجه به اینکه فسفریلاسیون سرین 334 منجر به ایجاد بار منفی در این موقعیت می شود، در این پژوهش سرین 334 با روش جهش زایی Quick change به آسپارتات (فسفومیمتیک) جهش داده شد. پس از تائید ایجاد جهش با تعیین توالی، آنزیم تیپ وحشی و جهش یافته در سیستم باکتریایی بیان و با روش کروماتوگرافی گرایشی تخلیص شد. فعالیت آنزیم جهش یافته با تیپ وحشی در دماهای 4، 15، 25، 30، 37، 45 و 60 درجه ی سانتی گراد بررسی شد. نتایج نشان داد که دمای مطلوب فعالیت آنزیم وحشی و جهش یافته به ترتیب 30 و 25 درجه ی سانتی گراد است. هم چنین آنزیم جهش یافته در دمای 4 و 60 درجه ی سانتی گراد فعالیت کمتری در مقایسه با آنزیم وحشی داشت. به نظر می رسد کاسپاز-9 دارای جهش در سرین 334 در دماهای پائین و بالا پایداری کمتری داشته باشد. به منظور تعیین پارامترهای سینتیکی شامل Km (ثابت میکائیلیس–منتن) Vmax (سرعت ماکزیمم) و kcat (ثابت سرعت کاتالیتیک)، فعالیت آنزیم های وحشی و جهش یافته در حضور غلظت های مختلف (04/0، 06/0، 08/0، 1/0 و 14/0 میلی مولار) از سوبسترای کروموژنیک Ac-LEHD-pNA کاسپاز-9 سنجش شد. Km آنزیم وحشی و جهش یافته به ترتیب 63/60 و 69/143 میکرومولار بود. بنابراین جهش سرین 334 به آسپارتات سبب افزایش Km و کاهش تمایل آنزیم به سوبسترا شد. kcat و Vmax دو آنزیم تفاوت معناداری نداشتند. به دلیل افزایش Km، ثابت ویژگی آنزیم جهش یافته کمتر از آنزیم وحشی بود. هم چنین کاسپاز-9 جهش یافته ی S334D مانند کاسپاز-9 وحشی برای دایمر شدن و فعالیت آنزیمی وابسته به آمونیوم سیترات بود. در مجموع با توجه به قرارگیری سرین 334 کاسپاز-9 در توالی آمینواسیدی مستعد فسفریلاسیون و کاهش Km و کارائی کاتالیتیک، به نظر می رسد فسفریلاسیون این ریشه اثر کاهشی بر تنظیم فعالیت کاسپاز-9 و مهار آنزیم توسط مهارکننده ی فیزیولوژیک آن (XIAP) داشته باشد. مطالعات بیشتر جهت بررسی توانایی کاسپاز-9 جهش یافته در فعال کردن سوبسترای فیزیولوژیک آن (پروکاسپاز-3)، مهار توسط XIAP و اجرای آپوپتوز پیشنهاد می-شود.